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domingo, 6 de enero de 2013

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR: PCR


La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase chain reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son :

1) Los primers: es la secuencia específica de nucleótidos del ADN que son específicos del organismo que estamos tratando de detectar.



2) La sonda, que en el caso de los sistemas de Tiempo real suele ir marcada en los extremos, con un elemento conocido como Quencher (o amortiguador) y con otro que es un agente Fluorogénico o Fluoróforo. Se puede describir como una sección complementaria para los primers del microorganismo que estamos buscando detectar.


3) El target u objetivo: es la secuencia simple complementaria a la que la sonda se unirá para generar su duplicación "n" veces en el ciclo que llamamos amplificación.

4) La Taq Polimerasa: es una enzima aislada del microorganismo Thermus aquaticus .Esta enzima es la responsable de generar copias o formar "polímeros" del target u objetivo, si tiene las condiciones necesarias de temperatura, acidez y oligoelementos como el cloruro de magnesio en una solución acuosa.

5) El termociclador: es un dispositivo diseñado para generar de manera alterna condiciones de temperatura en rangos de 55 hasta 95°C, que permiten que la Taq Polimerasa pueda cumplir con su función de generado de copias o "amplificar" el ADN. Normalmente corren 40-50 ciclos en períodos desde 60 segundos hasta poco menos de 5 minutos; por lo cual el proceso de termociclador tarda desde 45 mins hasta 3-4 horas.

6) El sistema más usado para detectar las copias generadas hasta hace poco menos de 20 años eran los sistemas de electroforesis en gel; en los últimos 10 años, surgió con más fuerza el uso de fluoróforos como el SYBR-GREEN, para poder medir la curva de fusión de los ciclos de amplificación y en los últimos 5 años, ha tomado más fuerza el uso de equipos termocicladores Tiempo Real, que usan fluoróforos altamente específicos y selectivos, que permiten incluso cuantificar  concentraciones en función de las curvas de generación de la fluorescencia

7) El uso de controles internos se utiliza para demostrar, comprobar, verificar y validar al mismo tiempo que realmente ocurrió la reacción de amplificación. Estos suelen añadirse en los tubos de reacción o en los capilares que se introducen en el termociclador.

Termociclador



La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los acidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa 

PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mínimo de tres etapas:

- el primero, en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena;

- el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde;

- el tercero, a 68 - 72 °C, facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. 



Debido a la elevada sensibilidad de la técnica, uno de los puntos más importantes a la hora de realizar una PCR en Tiempo Real, es la calidad del material de partida. Por ello, la extracción de los ácidos nucleicos de la muestra toma un papel crítico y fundamental. Aunque en los últimos años se han hecho grandes progresos en la simplificación de la extracción y purificación de los ácidos nucleicos bacterianos todavía no se ha encontrado un método automático universal que se pueda utilizar con cualquier tipo de muestra.

Debido a todo lo expuesto anteriormente se puede concluir que la PCR  es una valiosa herrmanienta a la hora de analizar tanto alimentos , aguas como muestras ambientales debido a su alta especificidad , a su rapidez y su capacidad para procesar grandes cantidades de muestras en un reducido tiempo

En próximos artículos se desarrollará más a fondo la técnica de PCR a tiempo real y las ventajas que supone para la seguridad alimentaria y ambiental, al tener una mejor especificidad y una sensibilidad muy superior a todos los metodos microbiológicos convencionales que muchas veces se utilizan para la determinacion de patógenos 

Laboratorios Biotalde está desarrollando varios proyectos de PCR a tiempo real  para la determinación y cuantificación de diferentes patógenos en alimentos, aguas y ambientes. 

2 comentarios:

  1. Interesante la pagina, aclara dudas de la terminologia especifica que se utiliza para referirse a la tecnica de la PCR. Aun tengo una consulta: si digiera templado o anillado es el cebador que se une al target o enzima o proteina estaria correcta utilizar cualquiera de esos terminos?

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